مجله علوم پزشكي مدرس دوره 0 شماره 3 و 4: از 03-95 پاييز و زمستان 386 عدم كارايي shrna اختصاصي بر عليه ژن EA دركاهش بيان پايدار در سلوله يا HEK 93 3 هاله وثقي مهرداد بهمنش * مجيد صادقيزاده - دانشجوي كارشناسي ارشد گروه ژنتيك دانشكده علوم پايه دانشگاه تربيت مدرس تهران ايران - استاديار گروه ژنتيك دانشكده علوم پايه دانشگاه تربيت مدرس تهران ايران 3- دانشيار گروه ژنتيك دانشكده علوم پايه دانشگاه تربيت مدرس تهران ايران دريافت مقاله: 87//3 پذيرش مقاله: 87/6/3 چكيده هدف: انكوپروتي ين EA در آدنوويروس تيپ ژنه يا آدنوويروس ميشود. اين پروتي ين با تغيير در عملكرد پروتي ينه يا 5 يك فاكتور تنظيمي است كه موجب كنترل فرايند رونويسي مهم سلولي از جمله p و prb سبب ايجاد شرايط مساعد براي همانندسازي ژنوم ويروس و ترانسفورم شدن سلولهاي ميزبان ميشود. هدف از تحقيق حاضر مهار پايدار بيان ژن EA در سلوله يا روي سلوله يا فوق بررسي شود. HEK 93 با استفاده از روش RNAi بوده تا آثار اين مهار مواد و روشها: ناحيه پروموتر U6 و shrna از دو پلاسميد اهدايي كنترل و پلاسميد كدكنندة sirna اختصاصي عليه ژن EA بهنامه يا سازهه يا ساخته شده با روش ليپوفكشن به سلوله يا در پلاسميد pcdna3. و psp-8 psp8-ea سرطاني HEK 93 ترانسفكت و كلونيه يا سابكلون شد. سپس سلولهاي ترانسفورم شده بر اساس مقاومت به آنتيبيوتيك ني ومايسين انتخاب شدند. تغييرات حاصل از اين عمل روي بيان ژن EA با استفاده از روش RT-PCR بررسي شد. نتايج: بررسيها نشانگر عدم تفاوت در ميزان بيان ژن EA در پي ترانسفكشن سلولها با پلاسميدهاي مورد نظر در دو گروه مهار و كنترل بود. براي بررسي احتمال تا ثير روند كلونينگ بر عملكرد پروموتر U6 سلولها با پلاسميدهاي اهدايي نيز ترانسفكت شدند كه مجددا عدم مهار بيان ژن EA مشاهده شد. نتيجهگيري: نتايج نشان دادند كه با وجود تكرار آزمايش هكرمهار قابل توجهي صورت نگرفت. براي كسب اطمينان از صحت توالي ژن EA قطعة تكثير شده در فرايند PCR كه شامل ناحية 3s اين ژن است توالييابيشد. نتايج حاصل از توالييابي با وجود جهش در يك نوكلي وتيد در ناحيهاي بود كه بهعنوان هدف براي sirna انتخاب شده بود. بنابراين ميتوان علت عدم مهار را به وجود اين جهش در ترادف ژن EA در سلولهاي استفاده شده در اين مطالعه مربوط دانست. كليدواژگان: HEK 93 EA آدنوويروس تيپ 5 RNAi.shRNA - مقدمه ردة سلولي (Human Embryonic Kidney) HEK 93 از سلولهاي اپيتليالي مشتق شده از بافت جنيني كلية انسان هستند كه از طريق ترانسفورم (Transformation) شدن با DNA آدنوويروس تيپ 5 به سلولهاي سرطاني تبديل شدهاند []. پروتي ينهاي EA و EB دو فاكتور كليدي در كنترل تكثير آدنوويروس در اين سلولها هستند. در پي نشاني مكاتبه: تهران دانشگاه تربيت مدرس دانشكده علوم پايه گروه ژنتيك صندوق پستي 45-75 Email: behmanesh@modares.ac.ir 95
مجله علوم پزشكي مدرس دوره 0 شماره 3 و 4 پاييز و زمستان 386 HindIII و (Fermentas) EcoRI هضم شد. سپس قطعات 6-- ترانسفكشن پلاسميدها با روش ليپوفكشن حاصل پس از جداسازي از ژل در محلهاي مشابه در پلاسميد pbluescriptii(-) سابكلون شدند. واكنش الحاق توسط آنزيم (Fermentas) T 4 DNA ليگاز و بر اساس روش پيشنهادي شركت سازنده انجام گرفت. در نهايت پلاسميدهاي ساخته شده با استفاده از آغازگر (Primer) عمومي ترادفيابي و ترادف حاصل با استفاده از نرمافزار Generunner بررسي شد. 4-- تهية سازههاي pcdna-u6snrnap-shrna و pcdna-u6snrnap براي برش قطعة حاوي پروموتر U6 و توالي shrna از پلاسميد psp8-ea و قطعة حاوي پروموتر U6 از پلاسميد (Fermentas) BamHI و HindIII از دو آنزيم psp8 استفاده و پس از جداسازي قطعات مورد نظر در محلهاي HindIII و BglII روي پلاسميد pcdna3. كلون شدند. براي تا ييد ساختمان سازههاي ساخته شده از روش كلوني (Colony PCR) PCR و هضم آنزيمي استفاده شد. سازههاي نهايي تحت عنوان pcdna-u6snrnap-shrna و pcdna-u6snrnap نامگذاري شدند. 5-- تعيين دوز كشنده G48 براي سلوله يا HEK 93 براي تعيين حداقل دوز كشندة آنتيبيوتيك (Sigma) G48 در سلولهاي HEK 93 ابتدا تعداد 0 4 5 سلول به ازاي هر چاهك در ظرف 6- خانه plate) (6-well در حضور 3 ميليليتر از محيط كشت كامل كشت داده شد. پس از گذشت 4 ساعت مقادير 00 600 400 و 800 ميكروگرم در ميليليتراز آنتيبيوتيك G48 به هر چاهك ظرف افزوده شد و يك چاهك نيز بهعنوان كنترل بدون آنتيبيوتيك در نظر گرفته شد. سپس محيط كشت سلولها در هر سه روز با محيط كامل همراه با مقادير مشخص شده از آنتيبيوتيك به مدت دو هفته تعويض شد. در پايان اين مدت و براساس نتايج بهدست آمده غلظت 400 ميكروگرم در ميليليتر بهعنوان دوز كشندة سلولهاي HEK 93 تعيين شد. (Lipofection) ترانسفكشن پلاسميدها به داخل سلوله يا HEK 93 با استفاده از ليپوفكتامين (Lipofectamin) (Invitrogen) و براساس روش پيشنهادي شركت سازنده انجام گرفت. بدين منظور تعداد 0 4 5 سلول به ازاي هر چاهك در ظرف 6- خانه به همراه 3 ميليليتر از محيط كشت حاوي سرم و فاقد آنتيبيوتيك كشت داده شدند. در روز بعد محيط سلولها تخليه و با (Phosphate Buffered Saline) PBS شستشو داده شدند. سپس ميكروگرم از هر يك از پلاسميدهاي مورد استفاده در تحقيق به 00 ميكروليتر (Invitrogen) Opti-MEM اضافه شد. در لولههاي جداگانه مقادير ميكروليتراز ليپوفكتامين تا رسيدن به حجم 00 ميكروليتراز Opti-MEM به ازاي هر چاهك با يكديگر مخلوط شدند. آنگاه اين محلولها با همديگر مخلوط و سوسپانسيون حاصل بهمدت 30 دقيقه در دماي اتاق بهصورت ثابت نگهداري شد. پس از آن 00 ميكروليتر Opti-MEM به سوسپانسيون فوق افزوده شد. در نهايت 400 ميكروليتر سوسپانسيون نهايي به هر چاهك كه حاوي 400 ميكروليتراز محيط RPMI-640 بدون سرم و آنتيبيوتيك بوده افزوده شد. پس از گذشت 5 ساعت انكوباسيون در 37 درجه سانتيگراد 800 ميكروليتر محيط كشت حاوي 0 درصد سرم به هر چاهك اضافه شد. سپس سلولها در 37 درجه سانتيگراد نگهداري شدند. 7-- انتخاب سلولهاي ترانسفكت شده (Transfected cells) پس از گذشت 7 ساعت از انجام ترانسفكشن بهمنظور انتخاب سلولهاي ترانسفكت شده با كمك آنتيبيوتيك G48 سلولهاي هر چاهك به نسبت :0 رقيق شده و مجددا كشت داده شدند. روز بعد سلولها با آنتيبيوتيك G48 و با غلظت 400 ميكروگرم در ميليليتر تيمار داده شده و بهدنبال آن محيط كشت سلولها هر سه روز يكبار با محيط كامل همراه با آنتيبيوتيك به مدت دو هفته تعويض شد. پس از ظاهر شدن كلونيهاي سلولي مقاوم به G48 سلولها تريپسينه شده و هر كدام به يك فلاسك T5 منتقل شدند. 97
عدم كارايي shrna بر عليه ژن EA هاله وثقي و همكاران نشانگر ب نشانگر الف 3 4 635 bp 3000 bp 000 bp 949 bp 3000 bp 000 bp 36 bp 37 bp 500 bp 400 bp 300 bp شكل الكتروفورز ژل آگارز محصولات حاصل از هضم دوآنزيمي پلاسميدهاي psp8-ea psp8 و II(-) pbluescript توسط آنزيمهاي محدودكنندة Hind III وI.EcoR فلا( ( ستونهاي و : نمايندة پلاسميدهاي هضم نشده ) هب عنوان كنترل) هستند ستونهاي 3 و 4: نمايانگر وجود قطعات 635 جفت بازي و 36 جفت بازي در نتيجة هضم پلاسميد psp8-ea و قطعات 635 جفت بازي و 37 جفت بازي در نتيجة هضم پلاسميد psp8 است (ب) ستون : نمايانگر قطعات 949 جفت بازي و جفت بازي در نتيجة هضم دوآنزيمي پلاسميد pbluescriptii ستون : پلاسميد هضم نشده كه به عنوان كنترل است. CACTCTTCCAGCCTTCCTTC :جلويي AGTCCGCCTAGAAGCATTTG :برگشتي سپس به مدت هفته سلولها در حضور آنتيبيوتيك G48 كشت داده شدند تا سلولها از نظر تعداد افزايش يابند. 8-- استخراج RNA تام سلولي و RT-PCR RNA تام سلولي پس از انجام روند انتخاب با كمك كيت (Cinnagen) RNX plus TM از سلولهاي ترانسفكت شده استخراج شد. براي ساخت cdna از 3 ميكروگرم RNA تام در حجم واكنش 0 ميكروليتر با كمك اليگومر تيميدين (Fermentas) RevertAid TM -MuLV و آنزيم (oligo-dt) و بر اساس برنامه ارايه شده توسط شركت استفاده شد. پس از انجام واكنش رونويسي معكوس به منظور تكثير قطعة مورد نظر واكنش PCR با استفاده از ميكروليتر از cdna تهيه شده به همراه واحد آنزيم /5 و MgCl (Fermentas) (Recombinant Taq) rtaq ميليمولار 00 dntps ميليمولار 5 پيكومول از هر آغازگر و در حجم نهايي 5 ميكروليتر انجام گرفت. ترادف آغازگرهاي بهكار رفته در اين تحقيق به شرح زير بود: داخلي از ميزان بيان ژن بتا- اكتين (β-actin) بهعنوان كنترل استفاده شد. محصولات PCR روي ژل آگارز درصد جداسازي و پس از رنگآميزي با اتيديوم برومايد bromide) عكسبرداري شدند. (Ethidium 3- نتايج -3- ساخت سازههاي pcdna-u6snrnap-shrna و pcdna-u6snrnap به منظور حصول اطمينان از ماهيت پلاسميدهاي اهدايي دكتر هكر و نيز جداسازي قطعات shrna و پروموتر براي كلون كردن در پلاسميد pbluescriptiisk(-) از هضم آنزيمي با كمك آنزيمهاي محدودكنندة HindIII و EcoRI استفاده شد. بررسي الكتروفورز ژل آگارز نشان داد كه اندازة قطعات حاصل از هضم آنزيمي مطابق با اندازههاي پيشبيني شده بودند (شكل ). پس از انجام سابكلونينگ پلاسميدهاي حاصل در ناحيه مورد نظر تعيين توالي شدند. نتيجة توالييابي نشان داد كه ترادف قطعة پروموتر + shrna دقيقا مطابق با ترادف مورد انتظار بود (شكل ). EA (AAN-080) GATAATCTTCCACCTCCTAGCC :جلويي CTCTCACGGCAACTGGTTTAATGG :برگشتي (NM-000) بتا- اكتين 98
ب( مجله علوم پزشكي مدرس دوره 0 شماره 3 و 4 پاييز و زمستان 386 الف ب شكل مقايسة قسمتي از توالي قطعة كلون شده در پلاسميد pbluescriptii U6snRNAp-shRNA (رنگ آبي) با ترادف اصلي پروموتر U6 snrna (رنگ سياه) فلا( ( و بخشي از گراف حاصل از توالييابي پروموتر ( snrna U6 را نشان ميدهد. پلاسميدهاي psp8 و psp8-ea در پلاسميد pcdna3. سابكلون شدند. صحت ساختار سازههاي ساخته شده با كمك 4 نشانگر 3 5 6 كلوني PCR و هضم آنزيمي تا ييد شد (شكل 3 ). -3- بررسي كارايي ترانسفكشن سلولهاي HEK 93 با استفاده از ليپوفكتامين شكل 3 الكتروفورز ژل آگارز محصولات حاصل از هضم آنزيمي پلاسميدهاي Hind III توسط آنزيمهاي محدودكنندة و pcdna3. psp8-ea psp8 BamH I وII Bgl ستون : نشاندهندة قطعات 458 جفت بازي و 900 جفت بازي حاصل از هضم آنزيمي پلاسميد pcdna3. توسط دو آنزيم Hind III و Bgl II ستونهاي و 3 : نمايانگر قطعات 656 و 34 و 96 جفت بازي حاصل از هضم دو آنزيمي پلاسميدهاي psp8-ea و psp8 با دو آنزيم Hind III و BamH I ستونهاي 5 4 و 6: نمايندة پلاسميدهاي هضم نشدة psp8-ea pcdna3. و psp8 (به عنوان كنترل) هستند. 458 جفت باز 656 جفت باز 900 جفت باز 34 جفت باز 96 جفت باز از آنجا كه پلاسميدهاي اهدايي فاقد ژن مقاومت به آنتيبيوتيك در سلولهاي يوكاريوتي براي انجام انتخاب و بيان پايدار بودند قطعات پروموتر U6snRNA و shrna از به منظور حصول اطمينان از كارايي روش ليپوفكشن ترانسفكشن مقدار يكسان از پلاسميد كدكنندة GFP به نام pcdebδ-gfp با سه مقدار 5 و 7 ميكروليتر از ليپوفكتامين در سلولهاي HEK 93 انجام گرفته و سه روز پس از انجام ترانسفكشن با كمك ميكروسكوپ معكوس فلورسانس كارايي ترانسفكشن ارزيابي شد. بررسي انجام شده نشانگر وجود تعداد قابل قبولي از سلولها بود كه پلاسميد حاوي ژن گزارشگر را حمل ميكردند. از آنجا كه تفاوت قابل توجهي در بين مقادير 5 و 7 ميكروليتر مشاهده نشد بنابراين مقدار 5 ميكروليتر بهعنوان مقدار مناسب از ليپوفكتامين براي انجام ترانسفكشن پلاسميدهاي اصلي انتخاب شد (شكل 4). 99
ج( د( ب( ب( ج( عدم كارايي shrna بر عليه ژن EA هاله وثقي و همكاران ب الف حاصل نشان داد که سطح بيان mrna ژن EA تفاوت قابل توجهي در بين دو گروه نداشته و ت قر ي ب ا مساوي است. (شکل ٦). ب الف د ج ج شكل 4 ترانسفكشن سلولهاي HEK 93 به روش ليپوفكشن با استفاده از پلاسميد گزارشگر حاوي GFP كه نور تابيده شده از سلولها نشانگر موفقيت ترانسفكشن است. فلا( ( نمايانگر مقدار ميكروليتر ( 5 ميكروليتر و ( 7 ميكروليتر از ليپوفكتامين است. با توجه به مشابهت ميزان ترانسفكشن در دو مقدار 5 و 7 ميكروليتر مقدار 5 ميكروليتر بهعنوان مقدار مناسب انتخاب شد. ( گروه كنترل فاقد پلاسميد را نشان ميدهد. 3-3- ترانسفكشن پلاسميدهاي pcdnapcdna-u6snrnap و U6SnRNAp-shRNA بهدنبال تعيين ميزان حساسيت سلولهاي HEK 93 نسبت به آنتيبيوتيك G48 سلولها با پلاسميد pcdna-u6snrnap-shrna بهمنظور مهار ژن EA و پلاسميد pcdna-u6snrnap بهعنوان پلاسميد كنترل با روش ليپوفكشن ترانسفكت شدند. بعد از دو هفته كلونيهاي مقاوم ظاهر و تغييرات احتمالي بيان ژن هدف در اين سلولها با روش RT-PCR نيمهكمي RT-PCR) (Semi-quantitative ارزيا يب شد (شكل 5). 4-3- بررسي بيان ژن EA در سلولهاي ترانسفورم شده پس از انجام ترانسفکشن و فرايند انتخاب روي سلولها به منظور بررسي ميزان موفقيت sirna کدشونده در کاهش مقدار ژن mrna RNA EA تام سلولي استخراج و سپس با استفاده از روش RT-PCR نيمهكمي در مقايسه با بيان ژن بتا اکتين بهعنوان کنترل داخلي بررسي شد. نتيجة شكل 5 عكس ميكروسكوپي از كلونيهاي ايجاد شده از سلولهاي ترانسفكت شده با پلاسميد حاوي ژن انتخابگر مقاومت به ني ومايسين فلا( ( سلولهاي ترانسفكت شده با پلاسميد pcdna-u6snrnap- سلولهاي ترانسفكت شده با پلاسميد- pcdna ( shrna U6snRNAp ( در گروه كنترل فاقد پلاسميد كلية سلولهاي گروه ج پس از طي دورة تيمار از بين رفتهاند. با توجه به نتايج بهدست ا مده اين احتمال وجود داشت كه پلاسميدهاي طراحي شده برای بيان پايدار shrna تحت تا ثير روند كلونينگ قرار گرفته و در نتيجه پروموتر کدكنندة shrna قابليت خود را از دست داده باشد. براي ارزيابي اين فرضيه ا زمايش ديگري انجام شد که هدف از ا ن بازسازي و تكرار ا زمايش انجام شده توسط گروه هکر بود. به اين منظور سلولهاي HEK 93 با پلاسميدهاي اهدايي اوليه psp8 و psp8-ea ترانسفکت شدند سپس RNA تام سلولي در ساعات ٤٨ و ٧٢ پس از ترانسفکشن استخراج و پس از ا ن ميزان مهار بيان ژن EA با استفاده از روش RT-PCR نيمهکمي بررسي شد. نتيجة حاصل نشان از عدم اختلاف در ميزان بيان ژن EA در حضور پلاسميد حاوي shrna در هر دو زمان نسبت به حالت کنترل داشت (شکل ٧). برای اطمينان از تکرارپذير بودن نتايج بهدست ا مده کليه مراحل ارزيابي براي تمامي پلاسميدها براي سه مرتبه تکرار شد. 00
مجله علوم پزشكي مدرس دوره 0 شماره 3 و 4 پاييز و زمستان 386 نوكلي وتيد جهش مشاهده شد (شكل 8). نشانگر 687) 3s EIA جفت باز) 549) s EIA جفت باز) (354 β-actin جفت باز) شكل 8 قسمتي از گراف حاصل از توالييابي ژن EA كه نشاندهندة وجود يك جهش در ناحية هدف براي توالي shrna است. 4- بحث شكل 6 مقايسة نيمهكمي بيان mrna ژن EA در سلولهاي ترانسفكت شده با پلاسميدهاي pcdna-u6snrnap (ستون ) و pcdna- U6snRNAp-shRNA (ستون ). سطح بيان mrna ژن بتا-اكتين به عنوان كنترل داخلي استفاده شد. ) كنترل منفي براي انجام روش.RT-PCR شكل 7 آناليز RT-PCR بيان mrna ژن EA در سلولهاي ترانسفكت شده در ساعات 48 با پلاسميد psp8-ea (ستون ) پلاسميد psp8 (ستون ) و گروه كنترل فاقد پلاسميد (ستون 3 ) در ساعات 7 با پلاسميد psp8-ea (ستون 4 ) پلاسميد psp8 (ستون 5 ) و گروه كنترل فاقد پلاسميد (ستون 6 ). كنترل منفي RT-PCR (ستون 7 ). سطح بيان mrna ژن بتا- اكتين به عنوان كنترل داخلي استفاده شد. 5-3- توالييابي ژن EA پس از اينكه سلولها با پلاسميدهاي گروه هكر ترانسفكتشد و مجددا عدم مهار بيان ژن EA مشاهده شد توالي ژن EA در سلولهاي HEK 93 مورد بررسي قرار گرفت. اين كار به منظور اطمينان از صحت عملكرد آغازگرهاي طراحي شده براي تكثير ژن EA در آزمايش RT-PCR و همچنين براي بررسي توالي ناحيه هدف توالي shrna بود. بدين منظور محصول PCR قطعة 3s اين ژن نشانگر براي توالييابي ارسال شد. نتايج بهدست آمده از توالييابي بيانگر ترادف قابل انتظار در تكثير cdna ژن EA بود. ولي در ناحيهاي كه به عنوان هدف براي sirna انتخاب شده بود در يك (RNA interference) RNAi امروزه با توجه به كاربردهاي فراواني كه در شناسايي عملكرد انواع ژنها در مسيرهاي مختلف سلولي دارد بسيار مورد توجه است. مولكولهاي دو رشتهاي sirna ميتوانند بسته به هدف نهايي به دو صورت ناپايدار يا پايدار بهكار گرفته شوند. از مزاياي بيان ناپايدار از طريق اليگوهاي پيش ساختة sirna سرعت بالاي مهار و آساني روش انجام از نظر زماني است. اما اليگوهاي پيشساختة sirna داراي طول عمر نسبتا كوتاه بوده وامكان ارزيابي سلولهاي ترانسفكت شده و ميزان آنها نسبت به سلولهاي ترانسفكت نشده وجود ندارد. به همين علت توانايي آنها در مهار بيان ژن مورد نظر محدود است. [6 7] به منظور غلبه بر نارساييه يا sirna از سيستمه يا يا ناقله يا روش بيان ناپايدار اليگوهاي بيان پايدار sirna به واسطة پلاسميد ويروسي استفاده ميشود. بيان shrna به واسطة ناقل (پلاسميد يا ويروس) نهتنها سبب بيان پايدار و بلندمدت اليگوها ميشود ساير معايب استفاده از اليگوهاي آماده را نيز ندارد [9 8]. در اين تحقيق از پلاسميد pcdna3. براي ساخت ناقلي مناسب براي كد كردن ترادف shrna اختصاصي بر عليه mrna ژن EA استفاده شد [9]. بررسي عملكرد پروتي ين EA آدنوويروس تيپ 5 به عنوان يك انكوپروتي ين ويروسي عامل بروز سرطان در انسان از طريق روش RNAi تنها توسط گروه هكر و همكاران در سال 004 انجام شده است. در تحقيق مورد اشاره سعي شده بود تا با مهار فعاليت ژن EA در سلولهاي سرطاني HEK 93 موجبات افزايش بيان پروتي ينهاي نوتركيب فراهم شود. به اين منظور با 687) 3s EIA جفت باز) 549) s EIA جفت باز) (354 β-actin جفت باز) 48h 3 4 7h 5 6 7 0
ي م عدم كارايي shrna بر عليه ژن EA هاله وثقي و همكاران استفاده از يك پلاسميد كدكنندة ترادف sirna اختصاصي عليه ژن EA تحت كنترل پروموتر U6 snrna بهطور ناپايدار و با استفاده از روش كلسيم فسفات موفق به مهار ژن EA به ميزان حدود 75 درصد پس از 7 ساعت شده بودند [5]. هدف از تحقيق حاضر مهار پايدار بيان ژن EA در مرحلة پس از رونويسي و مطالعة اثر آن بر ميزان تكثير سلولي و نيز بررسي بيان ژنهاي درگير با عملكرد اين پروتي ين همانند prb وp در سلولهاي HEK 93 به منظور بررسي امكان استفاده از آن براي كاربردهاي درماني احتمالي بود. براي حصول اين هدف با بررسي توالي ژن EA و واريانتهاي اصلي آن سعي شد كه در نواحي مشترك اين دو واريانت مناسبترين ترادف براي طراحي sirna اختصاصي به جهت مهار اين ژن طراحي شود. پس از يافتن ناحيه مناسب و با مقايسه با مقالة منتشر شده توسط گروه هكر و شباهت نزديك (99 درصد) بين اليگوي طراحي شدة تحقيق حاضر و آن گروه و با توجه به اين واقعيت كه نتايج ارايه شده بهوسيله آن گروه بيانگر كارايي بسيار مناسب shrna مورد استفاده آنان داشت تصميم به استفاده از ترادف انتخابي آنها گرفته شد. از آنجا كه اين پلاسميدها با نامهاي psp8 و psp8-ea فاقد نقشه و توالي بودند براي تعيين هويت و اطمينان يافتن از صحت ساختار آنها قطعات shrna به همراه پروموتر U6 snrna در ناقل pbluescripii(-) كلون و سپس توالييا يب شد. پس از تا ييد تواليهاي مورد نظر قطعات شامل پروموتر و shrna به پلاسميد pcdna3. براي بهرهگيري از ژن مقاومت به آنتيبيوتيك در سلولهاي يوكاريوتي منتقل شدند. سازههاي نهايي با استفاده از روش ليپوفكشن به سلولهاي HEK 93 ترانسفكت شدند و پس از انجام فرايند انتخاب كلونيهاي سلولي پايدار جداسازي شدند. همچنين كارايي روند استفاده از ليپوفكتامين در اين مطالعه با كمك پلاسميدهاي كدكنندة پروتي ين GFP بهعنوان پلاسميد گزارشگر نيز به اثبات رسيد. بررسي تا ثير بيان shrna بر بيان ژن EA در چند تكرار متوالي و در آزمايشهاي مهار جداگانه نشانگر عدم تفاوت در ميزان بيان ژن هدف در سلوله يا ترانسفكت شده با پلاسميد pcdna-u6snrnap-shrna در مقايسه با حالت كنترل بود. با توجه به نتايج حاصل از اين مرحله و براي بازسازي آزمايش مقاله هكر سلولهاي HEK 93 با پلاسميدهاي استفاده شده توسط گروه هكر ترانسفكت شدند. آناليز نتايج RT-PCR در 48 و 7 ساعت [5] پس از ترانسفكشن بيانگر عدم مهار بيان ژن EA توسط پلاسميد كدكنندة shrna در هر دو زمان نسبت به حالت كنترل بود. نظر به اينكه حتي در سلولهاي ترانسفكت شده با پلاسميدهاي گروه هكر نيز شاهد عدم تغيير در بيان ژن EA بوديم اين احتمال در نظر گرفته شد كه ممكن است جهش يا جهشهايي در توالي ژن EA سلولهاي HEK 93 مورد استفاده به وقوع پيوسته باشد. به منظور بررسي اين احتمال محصول PCR ژن EA توالييا يب شد. نتايج حاصل از آن نشاندهندة صحت ترادف بود ولي در ناحيهاي كه بهعنوان هدف براي sirna انتخاب شده بود شاهد يك جهش بوديم. بنابراين از آنجا كه وجود هر گونه جهش در ترادف mrna ژن هدف مولكول sirna موجب عدم اخلال موفقيتآميز در بيان آن ژن توسط روش RNAi خواهد شد و در اين راستا گزارش شده است كه حتي يك تغيير تك نوكلي وتيدي در ترادف نيز قادر به ايجاد نقصان كامل در فرايند شود ميتوان علت عدم مهار در اين مطالعه را وجود اين جهش عنوان كرد. هر چند احتمالات ديگري مانند نقص در فرايندهاي بلوغ و عملكرد مولكول sirna در سلولهاي HEK 93 استفاده شده در اين تحقيق را نيز نميتوان به طور كلي ناديده گرفت. بهطور خلاصه نتايج بهدست آمده به دنبال ترانسفكشن پلاسميدهاي كدكنندة shrna بر عليه ژن EA كه توسط هكر و همكاران استفاده شده بود و عدم مشاهدة كاهش بيان ژن EA در سلوله يا HEK 93 و مشاهدة جهش در توالي اين ژن نشان داد كه ايجاد جهش در توالي mrna ژن هدف در روش RNAi تواند موجب اختلال در مرحلة اتصال mrna به ناحية هدف و به دنبال آن عدم تجزية sirna مورد نظر و در نهايت اخلال در فرايند RNAi شود. علاوه بر اين صحت عملكرد مكانيسم عملآوري تواليهاي بازدارندة RNA در سلولها ميتواند جز عوامل تا ثيرگذار بر كاهش بيان ژن توسط روش RNAi شود. 0
مجله علوم پزشكي مدرس دوره 0 شماره 3 و 4 پاييز و زمستان 386 [] Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J Gen Virol 977; 36(): 59-74. [] Gallimore PH, Turnell AS. Adenovirus EA: remodelling the host cell, a life or death experience. Oncogene 00; 0(54): 784-35. [3] Keblusek P, Dorsman JC, Teunisse AF, Teunissen H, van der Eb AJ, Zantema A. The adenoviral EA oncoproteins interfere with the growth-inhibiting effect of the cdkinhibitor p(cip/waf). J Gen Virol 999; 80: 38-90. [4] Chattopadhyay D, Ghosh MK, Mal A, Harter ML. Inactivation of p by EA leads to the induction of apoptosis in DNA-damaged cells. J Virol 00; 75(0): 9844-56. [5] Hacker DL, Bertschinger M, Baldi L, Wurm 5- منابع FM. Reduction of adenovirus EA mrna by RNAi results in enhanced recombinant protein expression in transiently transfected HEK93 cells. Gene 004; 34: 7-34. [6] Cheng JC, Moore TB, Sakamoto KM. RNA interference and human disease. Mol Genet Metab 003; 80(-): -8. [7] Kim VN. RNA interference in functional genomics and medicine. J Korean Med Sci 003; 8(3): 309-8. [8] Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 00; 96(5567): 550-3. [9] Milhavet O, Gary DS, Mattson MP. RNA interference in biology and medicine. Pharmacol Rev 003; 55(4): 69-48. 03